Анализ ДНК в судебно-медицинской практике

Выделение ДНК

ДНК находится внутри каждой клетки организма, и этап выделения отвечает за разрушение ядра и высвобождение молекул ДНК в раствор. На этом этапе можно также отделить молекулы ДНК от всего остального клеточного материала и любого другого мусора, который может присутствовать в конкретном биологическом образце. Некоторые из этих материалов могут быть потенциальными "ингибиторами" для последующих этапов процедуры тестирования, поэтому важно попытаться изолировать только молекулы нуклеиновых кислот. Общими ингибиторами, обычно обнаруживаемыми в ходе судебно-медицинской экспертизы, являются гемоглобин и красители индиго. Два распространенных метода экстракции - это ручная экстракция фенол-хлороформом (иначе известная как органическая экстракция) и использование роботизированных система, таких как KingFisher производства Thermo Fisher Scientific.

Количественный анализ

Одним из стандартов, которым должны соответствовать все лаборатории по исследованию ДНК, является обеспечение того, чтобы ДНК, восстановленная в результате извлечения, была человеческой, а не из другого источника, такого как бактерии. Это делается путем количественного анализа, при котором измеряются и оцениваются качество и количество ДНК, присутствующей в образце. Кроме того, определение количества ДНК в образце имеет важное значение для успеха на следующем этапе, поскольку большинство систем амплификации требуют узкого диапазона входной ДНК. Этот шаг выполняется в судебно-медицинской экспертизе с помощью наборов Quantifiler Human Quantification Kit для количественного анализа ДНК. Необходимый для этого этапа прибор – реал-тайм ПЦР машина, такая как Thermo Scientific QuantStudio 5.

Амплификация

Амплификация ДНК осуществляется с помощью метода, известного как полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР - это процесс, в котором миллионы копий определенной последовательности ДНК могут быть сделаны всего за несколько часов. Это важно для судебно-медицинских образцов, поскольку ДНК, обнаруживаемая на месте преступления, ограничена как по количеству, так и по качеству. Этот молекулярный процесс "ксерокопирования" завершается точным нагревом и охлаждением образцов в термическом цикле в течение примерно 28 циклов.

Комплект для амплификации, используемый в судебно-медицинской практике, амплифицирует 15 различных областей ДНК, а также пол-детерминирующий маркер. Здесь используются наборы AmpFlSTR Identifiler, а затем образцы запускаются на обычном термоциклере, например Thermo Scientific Veriti или ProFlex. Этот процесс занимает около 15-30 минут для настройки, а затем около трех часов для работы на приборе-термоциклере.

Капиллярный электрофорез

После завершения реакции ПЦР получается большая смесь амплифицированных молекул ДНК, которые необходимо разделить, чтобы отличить различные молекулы друг от друга. Это достигается с помощью процесса, известного как капиллярный электрофорез. Молекулы ДНК несут отрицательный заряд, и после подачи электрического тока на образец молекулы попадают в очень тонкий капилляр, заполненный гелеобразным полимером, и мигрируют в сторону положительного анода на другом конце капилляра. Затем продукты ПЦР разделяются по размеру, так как более мелкие молекулы ДНК будут легче мигрировать через полимер, чем более крупные молекулы ДНК. Затем данные этого процесса собираются на компьютере, подключенном к прибору и с помощью программы разрабатывается профиль ДНК. В судебно-медицинских лабораториях проведения капиллярного электрофореза используются генетический анализаторы Applied Biosystems 3500 / 3500xL или SeqStudio.